Day5:荧光计数与滴度计算
感染72h后 ， 用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数 。 数出最后两孔的荧光细胞数 ， 计算2个重复孔内的总数之和并计算出平均数 ， 假设为A（倒数第二孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一孔的荧光细胞平均数） 。
慢病毒滴度计算公式： 病毒滴度 (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μl）
3. 慢病毒的使用 3.1 重组慢病毒体外感染细胞
不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同 。 建议在正式实验前 ， 在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值 。
3.1.1 慢病毒感染目的细胞预实验
为了节省病毒 ， 推荐使用96孔板进行预实验 。 操作步骤如下：
①第一天 细胞的准备
将目的细胞接种于96孔板中 ， 细胞融合率为50%为最佳 。 为保证细胞生长良好 ， 请保证细胞贴壁过夜 。
②第二天 病毒的稀释
取10μL慢病毒原液加入90μL培养液中做1:10稀释（10-1） ， 以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7 。 可根据实际情况降低或提高稀释倍数 。
③第二天 感染目的细胞
取出提前准备好的96孔板 ， 用准备好的病毒稀释液替代旧培养液 ， 注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组 。
④第二至十天 观察荧光或检测
慢病毒对细胞的感染较慢 ， 请在感染细胞后48、72、96、120小时分别观察细胞中荧光表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签 ， 请在48、72、96、120小时分别收获细胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达） 。
注意：
由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同 ， 在加入病毒稀释液后 ， 请于12-24小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适 。
3.1.2 慢病毒感染目的细胞
进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释 。 培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率 。
以24 孔培养板为例 ， 进行HEK293细胞的感染实验操作步骤如下：
注意：
实验前请按照不同的MOI 设置不同的感染孔 ， 并根据MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量 。
最适病毒用量的计算公式： 病毒用量TU=最佳MOI×细胞数目/病毒滴度
例如, 如果您目的细胞的最佳MOI=10 ， 您需要感染106的细胞 ， 那么您共计需要107 TU的病毒. 如果病毒滴度为1×108 TU/mL, 那么您实验需要的病毒量就是100μL.
① 第一天 细胞的准备
在24孔培养板接种若干孔 ， 每个孔内接种3-5×104个HEK 293细胞 ， 铺板时细胞的融合率为50%左右 ， 每孔培养液体积为300μL ， 进行病毒感染时细胞的汇合度约为70% 。
②第二天 病毒的准备
根据实验的实际情况和MOI 值 ， 用培养液准确稀释慢病毒原液 。
注意：
可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液 。
③第二天 感染目的细胞
在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液 ，混匀后放于CO2培养箱（37 ℃、5% CO2）孵育过夜 。
注意：
1）感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大 ， 请务必保证加入病毒前 ， 细胞处于良好的生长状态 。
2）若慢病毒对目的细胞的感染效率较低 ， 可通过提高MOI 值提高病毒的感染效率 ， 也可在培养液中加入维真生物助感染试剂ADV-HR来提高病毒的感染效率 。
④第三天 更换培养液
病毒感染细胞24小时后 ， 更换培养液 。
注意：
换液具体时间需视细胞状态而定 。 如果慢病毒对细胞有明显毒性作用 ， 影响细胞生长状态 ， 最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液后继续培养 。